硝酸纤维素膜NC膜的应用举例

1. 硝酸纤维素膜NC膜的应用举例

1.分子杂交杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜。固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。下面以放射性标记探针与固定在NC膜上的核酸进行杂交为例，杂交反应操作如下：① 配制所需试剂SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠。Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。预杂交液：6×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5%SDS，100?g/ml经变性或断裂成片段的鲑精DNA。② 将含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面，使其由下至上完全湿润，并继续浸泡2分钟。③ 将湿润NC膜装入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入预杂交液，尽可能挤出气泡，将袋封口，置68℃水浴1-2小时或过夜。④ 将双链探针做变性处理使成单链，即于100℃加热5分钟，然后立即置冰浴使骤冷。⑤ 从水浴中取出杂交袋，剪去一角，将单链探针加入，尽可能将袋内空气挤出去，重新封口，并将杂交袋装入另一个干净的袋内，封闭，以防放射性污染。⑥ 将杂交袋浸入68℃水浴，温育8-16小时。⑦ 取出杂交袋，剪开，取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5%SDS中，室温振荡5分钟，勿使滤膜干燥。⑧ 将NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1%SDS溶液的容器中，室温漂洗15分钟。⑨ 将NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分钟至1小时。⑩ 将NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5%SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分钟至1小时。⑾ 取出滤膜，用0.1×SSC室温稍稍漂洗，然后置滤纸上吸去大部分液体，待做杂交信号的检测。

2. 硝酸纤维素膜NC膜的生产原理

 通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品，宽度的大小直接和滚筒的大小相关，滚筒越大生产越方便，但设备的成本也越高.宽膜要经过切割才能成为我们购买到的25mm或18mm（或20mm）宽的膜，而长度上，成品卷膜和宽膜的长度是相同的.理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度，但这样会造成原料的浪费和人力成本的增加，后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中，综合用料成本和生产便利性基本确定了上面说的宽度，以此为标准。从生产过程，我们可以得知，NC膜本身已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的缓冲系统（虽然对纸条测试影响不会很大）。

3. 硝酸纤维素膜的NC膜的选择

以上谈了该行业的一些发展现状,那么我们大致了解后,回到最关心的问题,如何选择膜? 经常会遇到的问题是,我是做**项目的,我该选择那类膜?这里涉及到一个膜的分类标准问题,一个供应商可能提供这个膜是8um,但另一个供应商告诉你膜是135s的.这之间的区别与联系是什么?um指的是膜孔径,而从上面膜的生产过程,我们可以看出,膜的孔径实际上是没有办法界定的.由于干燥成型等过程的非绝对均一,膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为,每4cm膜,水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受,成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流.换算情况大致为: 8um=135s; 6um=180s.不同秒数的膜对反应有什么影响呢?首先,我们分析一下液体在膜上的运动过程. 一张长度为4cm的膜, 每隔1cm做一个标记, 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的. 而两张不同秒数的膜(例如135s, 180s)在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察,可以考虑用色素水溶液,非常明显.那么从这个试验可以看出,在通过同一T线喷点位置时, 金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜. 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短, 读数快, 那么灵敏度也就越低. 反之, 反应时间长, 读数慢, 也就灵敏度高. 同时还有一个问题是, 反应时间越长, 发生非特异性结合的可能性就越大, 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度. 所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡.其实我们并没有那么多选择. 经过使用实践, 各供应商一般都只提供两个型号, 就是135s和180s. 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多,但这两个型号的定货量就占了95%以上, 其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利. 135s一般用在双抗体夹心法, 180s一般用在竞争法. 你所要做的是,先选择其中的一个型号, 然后比较不同供应商同一个型号的差异, 由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同,这个差异可能大也可能小. 具体要根据试验结果来确定最后的选择.我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜, 这样成本高, 成功的几率也小.

4. 硝酸纤维素膜NC膜的膜的选择

以上谈了该行业的一些发展现状，那么我们大致了解后，回到最关心的问题，如何选择膜？经常会遇到的问题是，我是做**项目的，我该选择那类膜？这里涉及到一个膜的分类标准问题，一个供应商可能提供这个膜是8um，但另一个供应商告诉你膜是135s的。这之间的区别与联系是什么？um指的是膜孔径，而从上面膜的生产过程，我们可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流。换算情况大致为：8um=135s；6um=180s不同秒数的膜对反应有什么影响呢？首先，我们分析一下液体在膜上的运动过程。一张长度为4cm的膜， 每隔1cm做一个标记， 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的。而两张不同秒数的膜（例如135s， 180s）在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察，可以考虑用色素水溶液，非常明显。那么从这个试验可以看出，在通过同一T线喷点位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。其实我们并没有那么多选择。经过使用实践，各供应商一般都只提供两个型号，就是135s和180s。 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多，但这两个型号的定货量就占了95%以上，其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利。135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. 你所要做的是，先选择其中的一个型号， 然后比较不同供应商同一个型号的差异，由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同，这个差异可能大也可能小。具体要根据试验结果来确定最后的选择。我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜，这样成本高，成功的几率也小。

5. 硝酸纤维素膜NC膜的介绍

硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

6. 硝酸纤维素膜NC膜的质控方式

本节适合用膜量较大的公司用户参考。对于一卷膜可以用上几个月的用户来说，厂家的质控标准已经完全能满足你的要求，而不需要自己再做相关的质控。膜的质控虽属于原辅料QC职能，但由于其专业性强，一般都由小样调试人员来执行。膜入原料库后需要进行如下检验工作：1. 查收COA在购买时， 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书， 该证书被称为COA。如果你已经购买某一批次的膜， 而没有索取相应的证书， 如果有需要可提供批号向厂家要求补发。其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯。COA一般只提供给大客户， 对小客户是没有意义的。其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列。作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。2. 检查物理性能膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度。长度不需要检测。使用中可以关注长度上是否有断面重接现象， 断面多费料则多， 少数发生。厚度，由螺旋测微尺，选择几个测量点检测后算平均。膜生产的必测参数。主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速。宽度，普通直尺测量。物理性能一般都不会有什么大问题。毕竟检测标准客观，易把握。没有条件执行的厂家可省略。3. 跑水性能样本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易观测，需制作一个简易支架。操作：注入足够溶液到下部槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。4. 点样测试C/T线出线时间，其他试验条件相同情况下，记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异。灵敏度，比较不同样本浓度情况下，T线的变化是否和对照组同。一般每批次膜取前端一段用来测试即可。由于制造过程的不均一性， 不同批号的灵敏度会有一定差异，当大批量使用时，这种差异影响是非常大的，那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类。在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来。当进入后期生产调用时，就能根据这些分类，按照订单要求取用不同批号的膜，或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配。关于膜的批内差。批内差是肯定存在的，只是差距大小的问题，依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值，因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试。减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带。前面说过膜的生产方式，生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面，要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm的宽度。那么就有中间部分，和边缘部分之分.越靠近中间部分，膜的均匀性越好，边缘部分则相对要差，就造成了批内差。一般可以通过COA获得具体位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置。如果是试用某个型号的膜小样，还需要在以上检测后加入膜加速老化试验，包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验， 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文。